為確保產(chǎn)品的性能和無憂的操作，使用前請仔細閱讀本手冊，有任何疑問請咨詢本公司售后技術(shù)支持或當?shù)氐匿N售人員（聯(lián)系方式見附錄）。
1.產(chǎn)品介紹
ECH Focurose 4FF是將6-氨基己酸共價偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上制得的快流速純化介質(zhì)。它在間隔臂末端含有羧基，主要適用于偶聯(lián)含有自由氨基的小分子化合物（配基）制作親和純化介質(zhì)。
偶聯(lián)反應需要在酸性條件下（酸催化）進行，加入偶聯(lián)試劑（碳化二亞胺，例如EDC、CMC）可以促進游離氨基和游離羧基的縮合。
特點：
a.應用廣泛，可適用于偶聯(lián)含氨基的小分子化合物。
b.單點偶聯(lián)，易于控制。
c.流速快、產(chǎn)率高、易于放大。
表1：介質(zhì)性能參數(shù)
基質(zhì) | 高度交聯(lián)4%的瓊脂糖 |
粒徑范圍 | 45-165μm |
平均粒徑 | ≈90μm |
配基濃度 | 12-16umol羧基/ml(介質(zhì)) |
間隔臂 | 10個原子 |
pH穩(wěn)定性* | 3-14（長期） 3-14（短期） |
化學穩(wěn)定性 | 所有常用的緩沖液 |
流速 | 250-600cm/h |
操作壓力 | ≤0.3MPa |
貯存溶液 | 20%乙醇 |
貯存溫度 | 4-8℃ |
*：穩(wěn)定性取決于偶聯(lián)的配基
2.溶液制備
A液：0.0001M HCl。
B液：0.5M NaCl。
C液：0.1M Tris-HCl、0.5M NaCl，pH 8.3。
D液：0.1M 乙酸鈉、0.5M NaCl，pH 4.0。
E液：20%乙醇。
F液：0.02M Na2HPO4、0.5M NaCl， pH 7.0-7.4。
G液：0.1M Glycine-HCl，pH 2.7。
H液：1.0M Tris-HCl，pH 9.0。
3.樣品制備
3.1按50umol/ml的濃度將待偶聯(lián)樣品溶解在A液中，加入EDC或CMC至終濃度為0.1M，調(diào)整pH至4.5。
3.2樣品過濾（平均粒徑<45μm，用0.22μm過濾；45μm<平均粒徑<165μm，用0.45μm過濾；平均粒徑>165μm，用 0.8μm過濾）。
4.偶聯(lián)流程
4.1取所需量的介質(zhì)勻漿液至相應規(guī)格的砂芯漏斗中抽干。
4.2加入2倍介質(zhì)體積的A液，攪拌均勻后抽干；重復2次。
4.3加入2倍介質(zhì)體積的B液，攪拌均勻后抽干；重復2次。
4.4將介質(zhì)轉(zhuǎn)移到相應規(guī)格的反應器中。
4.5將待偶聯(lián)樣品加入到反應器中，室溫條件下溫和攪拌約24h(反應前期pH會發(fā)生變化，需要調(diào)節(jié)pH至4.5)。
4.6將介質(zhì)轉(zhuǎn)移到砂芯漏斗中抽干，保存收集容器中偶聯(lián)后的溶液。
4.6加入2倍介質(zhì)體積的C液，攪拌均勻后抽干。
4.7加入2倍介質(zhì)體積的D液, 攪拌均勻后抽干。
4.8重復“4.6-4.7”2次。
4.9加入2倍介質(zhì)體積的E液, 攪拌均勻后抽干；重復2次。
4.10將介質(zhì)轉(zhuǎn)移到相應規(guī)格的容器中，加入等體積的E液后保存?zhèn)溆谩?/span>
5.偶聯(lián)效率測定
5.1測定偶聯(lián)前后溶液中樣品含量（A280或其它含量測定方法），計算偶聯(lián)效率。
6.純化流程（以XK16/10為例）
6.1采用液滴對液滴（避免引入氣泡）的方式將柱子連接到層析系統(tǒng)上。
6.2用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
6.3用F液以5ml/min的流速沖洗10個CV。
6.4將樣品以5ml/min的流速上樣。
6.5用F液以5ml/min的流速沖洗至紫外吸收值平穩(wěn)（10-15個CV）。
6.6用G液以5ml/min的流速洗脫10CV。
6.7用純化水以5ml/min的流速沖洗5個CV。
6.8用E液以5ml/min的流速沖洗5個CV。
7.清洗（取決于待偶聯(lián)樣品的穩(wěn)定性）
7.1用6M鹽酸胍沖洗10CV，立即用純化水沖洗10CV。
7.2用70%乙醇沖洗10CV，立即用純化水沖洗10CV。
7.3用F液沖洗10CV。
8.常見問題
表2：常見問題及解決方案
問題 | 可能原因 | 解決方案 |
偶聯(lián)效率較低 | 1.A液、B液pH或鹽濃度不對 | 檢測A液、B液配制是否正確 |
2.偶聯(lián)時間不夠 | 延長偶聯(lián)時間 | |
純化時目標物不與介質(zhì)結(jié)合 或結(jié)合量較低 | 1.上樣量過載 | 降低上樣量 |
2.上樣速度過快 | 降低上樣流速 | |
3.蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集 | 及時有效地清洗介質(zhì) | |
4.樣品在儲存或上樣過程中失活 | 正確儲存待純化樣品以維持樣品的活性 | |
5.配基和目標物結(jié)合比例比較低 | 嘗試加大偶聯(lián)時配基濃度 | |
6.配基在偶聯(lián)或清洗過程中降解 | 檢測配基在偶聯(lián)或清洗中的穩(wěn)定性 | |
洗脫時沒有收集到目標物 或只收集到少量目標物 | 1.目標物沒有與介質(zhì)結(jié)合或結(jié)合量較少 | 降低上樣流速并檢查介質(zhì)的結(jié)合能力 |
2.洗脫條件不合適 | 更改相應洗脫條件或增強洗脫液的洗脫能力 | |
3.目標物在洗脫液條件下出現(xiàn)聚集沉淀 | 檢測目標物在洗脫液條件（鹽濃度和pH等）下的穩(wěn)定性 | |
目標物純度較低
| 1.樣品沒有經(jīng)過前處理 | 樣品上柱前必須要經(jīng)過離心或過濾 |
2.樣品粘度過高 | 用平衡液適當?shù)南♂寴悠?，降低粘度?/span> | |
3.洗雜不徹底 | 加大洗雜體積直至基線平穩(wěn)并與平衡液一致 | |
4.雜質(zhì)蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集沉淀 | 及時有效地清洗介質(zhì) | |
5.洗脫條件不佳，洗脫速度太快、梯度太陡。 | 調(diào)整洗脫條件 | |
6.目標物出現(xiàn)降解 | 檢測目標物的穩(wěn)定性 | |
7.柱料裝填效果不佳 | 重新裝填或購買 | |
8.雜質(zhì)出現(xiàn)非特異性吸附 | 適當選擇添加劑降低非特異性吸附 | |
9.分離柱頂部有較大儲樣體積 | 重新裝柱或降低儲樣體積 | |
10.介質(zhì)中有微生物生長 | 介質(zhì)使用完后，請及時正確保存介質(zhì) | |
介質(zhì)載量下降 | 1.上樣速度過快 | 降低上樣流速 |
2.蛋白或脂類在介質(zhì)中聚集，導致載量下降。 | 及時清洗介質(zhì) | |
3.使用次數(shù)過多，配基出現(xiàn)脫落 | 重新偶聯(lián)新的介質(zhì) | |
4.樣品在儲存或上樣過程中失活，不能較好的與配基結(jié)合 | 正確儲存待純化樣品以維持樣品的活性 | |
色譜峰上升緩慢 | 介質(zhì)裝填過緊 | 重新裝柱 |
色譜峰上升過緩或拖尾 | 介質(zhì)裝填太松 | 重新裝柱 |
柱床有裂縫或干涸 | 出現(xiàn)泄露或大體積氣泡引入 | 檢查管路是否有泄露或氣泡，重新裝柱 |
液流較慢
| 1.蛋白或脂類聚集 | 及時清洗介質(zhì)或濾膜 |
2.蛋白沉淀在介質(zhì)中 | 調(diào)整平衡液和洗脫液組分，以維持目標物的穩(wěn)定性和介質(zhì)的結(jié)合效率 | |
3.分離柱中微生物生長 | 所用試劑必須經(jīng)過過濾和脫氣； 樣品上柱前必須離心或過濾 |
9.訂購信息
表3：訂購信息表
產(chǎn)品 | 規(guī)格 | 貨號 |
ECH Focurose 4FF | 25ml | HQ030305025M |
ECH Focurose 4FF | 100ml | HQ030305100M |
ECH Focurose 4FF | 500ml | HQ030305500M |
ECH Focurose 4FF | 1L | HQ030305001L |
ECH Focurose 4FF | 5L | HQ030305005L |
ECH Focurose 4FF | 20L | HQ030305020L |
備注：大規(guī)格包裝產(chǎn)品或其它產(chǎn)品購買，請咨詢本公司當?shù)劁N售或售前技術(shù)支持。
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